Lactobacillus reuteri как лечебное средство при острой диарее у детей младшего возраста

Shornikova, Aino-Vieno; Casas, Ivan A.*; Isolauri, Erika; Mykkänen, Hannu  Vesikari, Timo
University of Tampere, Medical School, Тампере,Финляндия, компания BioGaia Biologies, Inc., Роли, Северная Каролина, США, University of Kuopio, Куопио, Финляндия.

Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 1997. №24(4). P. 399-404

Предпосылки: Некоторые штаммы лактобактерий способны ускорять выздоровление при острой диарее. Lactobacillus reuteri имеет человеческое происхождение и является естественным обитателем желудочно-кишечного тракта. В данном исследовании проводилось изучение применения экзогенно вводимых L. reuteri как лечебного средства при острой диарее.
Методы: В исследовании приняли участие 40 пациентов в возрасте от 6 до 36 месяцев, которые были госпитализированы с острой диареей (в 75% случаев ротавирусной этиологии). После согласия родителей пациенты были рандомизированы в одну из двух групп лечения и получали либо 1010-1011 колониеобразующих единиц L. reuteri, либо соответствующее плацебо ежедневно в течение всей госпитализации или до 5 дней. Проводилась оценка результатов лечения диареи и колонизации L. reuteri.

Результаты: Средняя (SD) продолжительность водянистой диареи после лечения составила 1,7 (1,6) дней в группе, получавшей L. reuteri, и 2,9 (2,3) дней в группе плацебо (p = 0,07). На второй день лечения водянистая диарея сохранялась лишь у 26% пациентов, которые получали L. reuteri, тогда как в группе плацебо этот показатель составил 81% (p = 0,0005). Культивирование лактобактерий из образцов стула показало, что назначение L. reuteri привело к колонизации желудочно-кишечного тракта. Из всех лактобактерий, которые были обнаружены у детей, получавших лечение, более 75% составили Lactobacillus reuteri.

Заключение: Lactobacillus reuteri является эффективным лечебным средством при острой ротавирусной диарее у детей. Необходимо проведение дальнейших исследований для подтверждения полученных данных и для изучения всех возможностей лечебного применения L. reuteri при острой вирусной диарее.

Нормальная микрофлора важна для защиты организма человека от заболеваний желудочно-кишечного тракта (1,2). Во время острой диареи нормальная кишечная микрофлора существенно изменяется, включая уменьшение содержания бактерий рода Lactobacillus, Bacteroides и Bifidobacterium (2-5). В некоторых исследованиях было показано, что назначение пробиотических препаратов способно регулировать микробный баланс организма и уменьшать выраженность эпизода острой диареи (6-8). Штамм Lactobacillus GG (LGG) продемонстрировал способность ускорять выздоровление при ротавирусном гастроэнтерите у детей и усиливать иммунный ответ со стороны кишечника (9-11). Для лечения острой диареи также используются и другие коммерчески доступные препараты на основе молочнокислых бактерий, таких как L. casei subsp. rhamnosus (Lactophilus), L. delbrueckii subsp. bulgaricus и других, даже если эффективность этих препаратов не была доказана официально (11).

Первоначально Lactobacillus reuteri были выделены из грудного молока. Они представляют собой наиболее распространенный вид лактобактерий, которые обнаруживаются в желудочно-кишечном тракте человека и животных (12). Как и другие лактобактерии, L. reuteri образуют конечные продукты метаболизма с кислотными свойствами (молочную и уксусные кислоты), которые обладают выраженной противомикробной активностью (13). Известно, что L. reuteri колонизируют кишечник человека после употребления молочных продуктов; в настоящее время подобные продукты продаются в Швеции. Следовательно, возможно производство легко потребляемых в пищу форм L. reuteri, которые, при их доказанной эффективности, можно было бы использовать для лечения диареи.
Безопасность L. reuteri была доказана при экзогенном введении здоровым взрослым добровольцам (14) и госпитализированным детям (A. Shornikova и др., неопубликовано), а терапевтический потенциал продемонстрирован в экспериментальной модели колита на крысах (15). В данном исследовании нами проводилась оценка L. reuteri как лечебного средства при острой диарее у детей младшего возраста, в основном связанной с ротавирусной инфекцией, а также изучение степени колонизации желудочно-кишечного тракта лактобактериями и L. reuteri при назначении экзогенно вводимых L. reuteri и без него. Кроме этого, нами было изучено влияние L. reuteri на иммунный ответ на ротавирусы после диареи ротавирусной этиологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты и дизайн исследования

Исследование проводилось в промежутке между 29 января и 3 июля 1995 г., в соответствии с эпидемическим сезоном ротавирусной инфекции. Исследование было рандомизированным, двойным слепым. Группу субъектов исследования составили 41 хорошо развитый пациент (доля мужского пола 61%) в возрасте от 6 до 36 месяцев, которые поступали в педиатрическое отделение Университетской больницы города Тампере по поводу острой диареи длительностью менее 7 дней и одним или более эпизодом водянистой диареи за предшествующие 24 часа. Включение или исключение детей из исследования проводилось на основании следующих критериев включения и исключения. Пациенты подходили для участия в исследовании, если: их возраст составлял 6-36 месяцев, они были госпитализированы по поводу острой диареи, в анамнезе отмечалось употребление продуктов из коровьего молока (молока, йогурта, детской молочной смеси и др.) как часть повседневного питания, а также при наличии родителя или официального опекуна, подписавших информированное согласие. Пациенты исключались из исследования, если: получали иммуносупрессивную терапию или страдали иммунодефицитом, в анамнезе отмечалась аллергия к коровьему молоку; если у пациента имелось серьезное сопутствующее заболевание; если он принимал исследуемый продукт за последний месяц или же если родитель или официальный опекун отказывались подписать информированное согласие.

Согласно подготовленному графику рандомизации в каждую группу лечения (L. reuteri и плацебо) должны были войти по 50% включенных в исследование пациентов. По мере включения в исследование пациентам последовательно присваивались рандомизационные номера.

При поступлении в больницу проводилось взвешивание и объективное обследование детей, а также оценка степени дегидратации. Острая потеря веса рассчитывалась как разница между ожидаемым весом (согласно индивидуальным ростовым картам) и измеренным весом. После этого проводилось вычисление  дефицита жидкости (процента дегидратации), исходя из клинических признаков дегидратации и острой потери веса; если диарея продолжалась, по крайней мере, 3 дня, то для отражения потери веса в силу недостаточного поступления калорий для каждого дня вычиталось от 0,5 до 1%. При исследовании образцов крови, полученных при поступлении, были определены уровни натрия и калия в сыворотке крови, а также кислотно-основное равновесие.
После госпитализации ведение пациентов осуществлялось в соответствии со стандартами лечения: начиная с оральной регидратации, с последующим быстрым восстановлением полноценного питания (16). Противодиарейные препараты не применялись. Оральная регидратация проводилась в течение 6 часов раствором, содержащим натрий (60 ммоль/л) и глюкозу (84 ммоль/л); объем раствора в два раза превышал дефицит жидкости (минимальная доза составила 30 мл/кг) (17). После первоначальной регидратации для возмещения текущих потерь жидкости при диарее и рвоте также назначался раствор для оральной регидратации.

Пациенты были поровну рандомизированы в одну из двух групп. Пациенты в группе 1 (n = 19) получали 1010-1011 КОЕ L. reuteri штамма SD 2112 один раз в день. Пациенты в группе 2 (n = 21) получали соответствующее плацебо один раз в день. Плацебо состояло из сухого молочного порошка, не содержащего жира. Изготовление, контроль и гарантия качества лекарственной формы L. reuteri и плацебо перед поставкой обеспечивались компанией Bio-Gaia Biologics, Inc. (Роли, Северная Каролина, США). Каждая доза в 1 г, содержащая 1010-1011 КОЭ L. reuteri на грамм, была упакована в лиофилизированной форме в стерильные запечатанные пластиковые флаконы. В качестве носителя использовался сухой молочный безжировой порошок. В ходе исследования препарат хранился при температуре -20Å°C. Разведение 1 г L. reuteri в лиофилизированной форме или плацебо проводилось в 50-100 мл выбранного раствора. Перед смешиванием с препаратом горячая пища должна была остыть. Введение назначенного препарата начиналось немедленно после получения информированного согласия. Пациенты получали L. reuteri или плацебо в течение 5 дней или все время нахождения в больнице, если оно длилось меньше.
Взвешивание пациентов проводилось после проведения регидратации, а затем ежедневно в палате. Медицинская сестра регистрировала количество и внешний вид стула, а также число эпизодов рвоты. Характер стула оценивался как водянистый, жидкий или твердый. Длительность диареи подсчитывалась вплоть до последнего эпизода водянистого стула и выражалась как количество дней в десятичном исчислении. Выписка пациентов из больницы осуществлялась по клиническому решению лечащего врача. При возникновении диареи в течение периода наблюдения (1 месяц) пациентов просили связаться с исследователем. Через 1 месяц проводился повторный забор образцов крови.

Лабораторные методы

В больничной лаборатории с помощью стандартных методов определялись концентрации натрия и калия в сыворотке крови и кислотно-основное равновесие крови.
Определение ротавирусных антигенов проводилось с помощью коммерческой системы для иммуноферментного анализа (Dakopatts AS, Дания) в Отделении вирусологии Медицинской школы при Университете города Тампере. Забор образцов крови для серологического исследования на ротавирусы проводился при госпитализации или на следующий день, а также 4 недели спустя. С помощью твердофазного иммуноферментного анализа (методика ELISA) были определены антитела к ротавирусам класса IgA [18].

У каждого участника исследования произведен забор образцов стула для определения общего содержания лактобактерий и количества L. reuteri. Образцы фекалий отбирались исходно (до назначения исследуемого продукта), через 48 часов после введения препарата и при выписке из больницы. Для проведения микробиологического анализа забиралось не менее 2 г фекалий. Образцы подвергались гомогенизации и разведению 0,1% пептонной водой для получения конечного соотношения 1:5. Пять аликвот по 1,6 мл каждого из хорошо перемешанных растворов подверглись быстрой заморозке и хранились при температуре -70 Å°C. Разведенные образцы кала были отправлены в лабораторию BioGaia Biologics, Inc. (Роли, Северная Каролина, США) для определения общего содержания лактобактерий и количества L. reuteri.
В лаборатории Отделения лечебного питания Университета города Куопио проводилось определение уреазной активности в фекалиях, как это было описано ранее (19,20).

Статистические методы
Статистический анализ проводился с использованием программы StatView IV. Для выявления статистических различий между группами исследования использовался двусторонний t-критерий Стьюдента, вариационный анализ и критерий хи-квадрат. Двусторонний t-критерий применялся для сравнения результатов повторных измерений. Поскольку распределение значений уреазной активности было несимметричным, то представленные данные являются средним измерений внутри межквартильного размаха между 25 и 75 центилем. В данном анализе был применен непараметрический критерий Уилкоксона.

Этические соображения
Протокол исследования был одобрен Этическим наблюдательным комитетом Университетской больницы города Тампере.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Исходно в исследование был включен 41 пациент. Один ребенок из группы плацебо был исключен из исследования, поскольку в образцах стула были обнаружены L. reuteri. Его сестра, также включенная в исследование, вошла в группу, получавшую лечение L. reuteri. Очевидно, что между детьми произошла перекрестная контаминация. Из остальных 40 детей 19 и 21 пациент вошли в группу, получавшую L. reuteri и плацебо, соответственно. У 30 пациентов (75%) с помощью иммуноферментного анализа в образцах стула были обнаружены ротавирусы. В группе, получавшей L. reuteri, ротавирусы были найдены у 12 пациентов (63%); в группе плацебо – у 18 детей (86%).

В совокупной группе исследования (n = 40) средняя (SD) продолжительность диареи до начала лечения составила 3,0 (1,7) дня. При поступлении в больницу у большинства пациентов отмечалась умеренная дегидратация, в среднем 3,4 (1,4)%. Уровень натрия в сыворотке крови находился в пределах от 130 до 144 ммоль/л, в среднем 138 ммоль/л. У пациентов с положительным результатом анализа на ротавирусы (n = 30) диарея дома продолжалась 2,6 (1,5) дней, тогда как для пациентов, у которых ротавирусы обнаружены не были, это значение составило 3,1 (1,9) дня (различие не существенно). Степень дегидратации у ротавирус-положительных детей не была существенно больше, чем у ротавирус-негативных пациентов, однако при поступлении у них чаще отмечался метаболический ацидоз (дефицит оснований 7,8 (4,3) ммоль/л), чем у детей с отрицательным анализом на ротавирусы (средний дефицит оснований 4,8 (3,8) ммоль/л), соответственно (p = 0,07). Характеристики пациентов, получавших L. reuteri или плацебо, представлены в Таблице 1.

^a t-критерий Стьюдента

При поступлении группы были сравнимы между собой, за исключением того, что у пациентов из группы лечения с помощью L. reuteri дегидратация была более выражена, чем в группе плацебо.

Исход лечения в двух группах исследования был схожим по восстановлению массы тела, коррекции ацидоза и уровней электролитов (Таблица 2). Средняя продолжительность водянистой диареи в группе, получавшей L. reuteri, была меньше (p = 0,07). Дни 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6 рассчитывались как 24-часовые периоды до или после начала лечения L. reuteri или введения плацебо. Влияние L. reuteri на продолжительность водянистой диареи также показано в Таблице 3 и на Рисунке 1. На второй день лечения водянистая диарея сохранялась лишь у 26% пациентов, получавших L. reuteri, по сравнению с 81% пациентов в группе плацебо. На второй день частота эпизодов водянистой диареи составила 1,0 (SD=2,3) в группе лечения L. reuteri и 2,5 (SD=2,3) в группе плацебо (p = 0,05) (Рисунок 1); на третий день средняя частота составляла 0,5 (SD=1,9) и 1,7 (SD=2,6) в группе, получавшей L. reuteri и плацебо, соответственно (p = 0,12).

ТАБЛИЦА 2. Исходы лечения пациентов, получавших Lactobacillus reuteri или плацебо

 ^a t-критерий Стьюдента

ТАБЛИЦА 3. Число и процент (%) пациентов с водянистой диареей

^а День 1 соответствует первому 24-часовому периоду от начала лечения
^b Критерий хи-квадрат

РИСУНОК 1. Частота эпизодов водянистой диареи за период 24 часа у пациентов, получавших Lactobacillus reuteri и плацебо.

Начиная со второго дня лечения, у пациентов, получавших L. reuteri, реже возникала рвота, по сравнению с пациентами из группы плацебо (Таблица 4). После первого дня лечения в группе, получавшей L. reuteri, рвота почти прекратилась, тогда как в группе плацебо у нескольких пациентов она сохранялась вплоть до 6 дня.

ТАБЛИЦА 4. Число и процент (%) пациентов с рвотой

^а День 1 соответствует первому 24-часовому периоду от начала лечения
^b Критерий хи-квадрат  

Назначение L. reuteri приводило к удовлетворительной колонизации желудочно-кишечного тракта. Через 48 часов после назначения L. reuteri в фекалиях отмечен чистый прирост показателя степени концентрации L. reuteri в 5 раз. Для общего содержания лактобактерий через 48 часов также отмечено увеличение показателя степени в 2 раза (Таблица 5). L. reuteri составляли 75% от общего количества лактобактерий, обнаруженных в образцах стула. У детей, получавших плацебо, общее содержание лактобактерий в фекалиях было низким, а L. reuteri не обнаруживались ни в одном из образцов стула. В ходе всего исследования общее количество бактерий в фекалиях детей, получавших плацебо, оставалось на уровне 101-103 КОЕ/г.

ТАБЛИЦА 5. Общее количество лактобактерий и Lactobacillus reuteri в фекалиях пациентов, получавших L. reuteri или плацебо.